Phương pháp nhuộm soi trực tiếp Zielh-Neelsen tìm AFB

Home » Cận lâm sàng » Phương pháp nhuộm soi trực tiếp Zielh-Neelsen tìm AFB
1. Nguyên tắc tiến hành:
   Nhuộm Zielh-Neelsen được sử dụng cho nhuộm soi AFB. Chất nhuộm carbol fuchsin (Đỏ Fucsin) dưới tác dụng của nhiệt độ sẽ gắn hữu cơ với axit mycolic có trong vách tế bào vi khuẩn và không bị mất sau khi tẩy mầu và nhuộm với xanh methylene, tạo hình ảnh trực khuẩn bắt mầu hồng đỏ đặc trưng cho vi khuẩn họ Mycobacteria trong vi trường, khi soi đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học.

 
Hình ảnh vi khuẩn lao sau khi nhuộm soi dưới kính hiển vi
         AFB: Acid Fast Bacillus (trực khuẩn kháng axít).
2.  Chuẩn bị dụng cụ
–          Cabin an toàn.

–          Bể nhuộm.
–          Lam kính.
–          Đèn cồn.
–          Que phệt bệnh phẩm.
–          Túi đựng rác thải y tế.

–          Hộp đựng bông cồn dùng cho lau khử trùng dụng cụ.
–          Bông, gạc.

3.   Hoá chất, thuốc thử

  • Dung dịch nhuộm carbon fuchsin

Dung dịch A:        L.O.C. High Suds (Amway)      0.6 ml                       Nước cất   100 ml

             Dung dịch B:          Fuchsin   1 g                                   Cồn ethyl tuyệt đối    10 ml
  • Dung dịch cồn – axit 3%
                        Absolute ethyl alcohol                 95ml
                        Nước cất                                    2 ml

                        Acid Clohydric đậm đặc               3 ml
  • Dung dịch xanh Methylene 0,25% thành phần gồm          
            Xanh Methylene                          0.25 g
            Nước cất                                    99 ml
            Axit Acetic                                  1 ml

4. Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu

Cách lấy mẫu bệnh phẩm

 

–          Chọn loại hộp miệng rộng, dùng một lần, làm bằng nhựa trong, không ròn, không dễ vỡ, và không rò rỉ.
–          Đưa bệnh nhân hộp đựng đờm đã gián nhãn, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, hướng dẫn cách đóng nắp đảm bảo bệnh phẩm không rò rỉ và yêu cầu không làm mất, mờ thông tin trên nhãn.

–          Hướng dẫn bệnh nhân hít thở sâu 2-3 lần, sau đó ho thật sâu từ trong lồng ngực và khạc đờm vào ống đựng đờm bằng cách đưa miệng ống vào sát miệng.

–          Quá trình lấy mẫu được thực hiện ở phòng có thiết bị thông gió.

–          Đảm bảo lấy được mẫu đờm đủ chất lượng và số lượng: 2-3ml đờm đặc, nhày. Nếu chưa đủ, yêu cầu bệnh nhân lấy thêm một mẫu đờm nữa.

–          Đưa bệnh nhân một ống đựng đờm khác đã gián nhãn và ghi thông tin bệnh nhân để lấy đờm vào sáng sớm. Yêu cầu bệnh nhân súc miệng sạch trước khi ho khạc đờm.

      Cách bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

–          Nếu bệnh phẩm được lấy tại thực địa và chưa thể thực hiện xét nghiệm ngay, bệnh phẩm phải được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 3-4 ngày.

–          Bệnh phẩm phải được giữ ở nhiệt độ lạnh hoặc mát trong hộp vận chuyển đặc biệt có khóa cài an toàn, chống rò rỉ, chịu va đập mạnh và được dán nhãn báo hiệu hộp luôn phải được đặt theo phương thẳng đứng 

5.  Các bước tiến hành

 Bước 1: Chuẩn bị dung dịch nhuộm bằng cách trộn 50ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B để được dung dịch nhuộm.

Bước 2: –         Dùng lam kính mới, dán nhãn, ghi mã bệnh phẩm trên nhãn. đánh dấu vị trí phết bệnh phẩm bằng một vòng tròn bằng bút mực vào mặt dưới của lam kính;  
–         Trong cabin an toàn, mở hộp bệnh phẩm, chọn vị trí đờm đặc, nhày, màu vàng, phệt và dàn đều bệnh phẩm vào mặt trên ở vị trí đánh dấu. Cố định bằng cách hơ qua lại 3 lần trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn gas cháy nhẹ, mỗi lần 3-5 giây.
Bước 3: Đặt lam kính lên giá đỡ của bể nhuộm, phủ đầy bề mặt lam kính với carbon fuchsin.
Bước 4: Hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn gas, đưa đi đưa lại chậm rãi đến khi dung dịch bốc hơi, để trong 5 phút. Giữ nhiệt độ không để sôi dung dịch carbon fuchsin, bổ xung thêm dung dịch nhuộm nếu dung dịch bị cạn đi.
Bước 5: Rửa lam kính với nước.
 
 
Bước 6: Rửa lam kính với cồn – axit 3% để tẩy mầu trong 1- 5 phút cho đến khi các vết nhuộm sạch đi.

 

Bước 7:
 Rửa kỹ lam kính với nước và làm sạch các vệt nước đọng trên lam.

 

Bước 8: Phủ đầy bề mặt lam kính với dung dịch xanh methylene 0,25%, để trong 1 phút.  
Bước 9: Rửa kỹ lam kính với nước. để ráo nước và soi dưới kính hiển vi, vật kính dầu. Đọc kết quả. Lưu lam kính xét nghiệm đến khi có yêu cầu hủy.  

6.  Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm 

 


7.  Đọc kết quả

Bảng hướng dẫn đọc kết quả nhuộm soi AFB

Số lượng AFB Kết quả Mức độ Số vi trường cần kiểm tra
0 Âm tính Âm tính 100
1-9/100 vi trường Dương tính Ghi số lượng vi khuẩn 100
10-99/ 100 vi trường Dương tính 1+ 100
1-10/ 1 vi trường Dương tính 2+ 50
>10/ 1 vi trường Dương tính 3+ 20
     Nếu kết quả dương tính, độ tin cậy của xét nghiệm nhuộm soi xác định AFB đạt 99%.

 

Tiêu bản phải được giữ trong hộp bảo quản sau khi đã đọc kết quả để dùng cho việc đánh chất lượng sau này. Tiêu bản chỉ có thể hủy sau khi lưu trữ 6 tháng

Theo viện vệ sinh dịch tễ trung ương

LEAVE A COMMENT